ELEKTROFORESIS PROTEIN

Protein biasanya mempunyai muatan netto positif atau negatif yang mencerminkan campuran asam amino bermuatan yang dikandungnya. Jika sebuah larutan yang mengandung molekul protein mengalami suatu medan listrik, protein itu akan bermigrasi dengan laju yang bergantung pada muatan netto, ukuran serta bentuknya. Teknik ini dikenal dengan istilah elektroforesis. Awalnya, elektroforesis digunakan untuk memisahkan campuran protein baik yang berada dalam suatu larutan air yang bebas maupun yang terikat dalam suatu matriks zat padat yang berpori, misalnya dalam tepung pati.

Namun, mulai pertengahan tahun 1960, teknik elektroforesis berkembang menjadi elektroforesis gel poliakrilamida SDS (SDS-page) yang digunakan untuk menganalisa protein. Metode ini menggunakan gel poliakrilamida dengan strukturnya yang membentuk susunan saling menyilang sebagai suatu matriks lembam yang harus dilalui oleh protein. Gel tersebut biasanya disiapkan langsung sebelum digunakan dengan cara polimerisasi dari monomer-monomernya. Selain itu, ukuran pori gel dapat diatur sedemikian rupa sehingga cukup kecil untuk menghambat migrasi molekul-molekul protein yang dianalisis. Protein-protein itu sendiri tidak sekedar dilarutkan dalam air tetapi dicampur dengan semacam detergent yang bermuatan sangat negatif, yaitu natrium dodesil sulfat atau SDS. Karena  detergent ini mengikatkan diri dengan bagian-bagian yang hidrofobik pada molekul-molekul protein sehingga molekul-molekul itu menguraikan lipatan-lipatannya menjadi rantai-rantai polipeptid yang memanjang, maka setiap molekul protein terbebas dari persekutuannya dengan molekul-molekul protein lain atau dengan molekul-molekul lipid dan membuatnya dapat larut secara bebas dalam larutan detergent. Di samping itu, sering pula ditambahkan sebuah agen pereduksi seperti merkaptoetanol untuk memutuskan setiap mata rantai SDS dalam protein-protein supaya semua unsur polipeptida dalam molekul-molekul yang memiliki banyak subunit itu dapat dianalisis secara terpisah.

Apabila sebuah campuran protein dilarutkan dalam SDS kemudian dielektroforesis melalui suatu lapisan gel poliakrilamida maka setiap molekul protein akan mengikat sebagian besar molekul-molekul detergent yang bermuatan negatif, sehingga muatan setiap molekul protein menjadi negatif. Ini menyebabkan molekul-molekul tersebut bermigrasi ke arah elektroda positif apabila mengalami tegangan listrik. Protein-protein yang berukuran sama cenderung menunjukkan perilaku yang serupa,  dan hal ini disebabkan oleh:

1.      Struktur yang semula telah dijadikan tidak terlipat lagi oleh SDS sehingga semua mempunyai bentuk yang sama.

2.      Masing-masing mengikat SDS dalam jumlah yang sama sehingga karena itu mempunyai muatan negatif yang sama pula.

Protein-protein lebih besar dengan muatan yang juga lebih besar, akan mengalami gaya listrik yang lebih besar sekaligus gaya tarik yang lebih besar pula.  Dalam larutan yang bebas, kedua efek itu akan saling menghilangkan, tetapi dalam jalinan gel poliakrilamida, yang bertindak sebagai penyaring molekul, protein-protein besar mengalami hambatan yang jauh lebih besar dibanding protein-protein kecil. Akibatnya, dalam suatu campuran yang kompleks protein-protein saling terpisah membentuk pita-pita yang tersusun menurut berat molekul setiap protein.

Protein yang besar dengan mudah dapat dideteksi melalui pewarnaan gel dengan zat pewarna biru Coomassie, misalnya, sedangkan protein kecil dideteksi melalui perlakuan dengan zat pewarna perak (asalkan banyaknya protein tersebut dalam suatu pita tidak kurang dari 10 ng). Sebuah protein tertentu dapat diidentifikasi pada gel semacam itu dengan mencampur semua protein dengan suatu antibodi yang telah dihubungkan dengan sebuah isotof radioaktif, dengan suatu enzim, atau dengan sebuah zat warna berpendar. Hal ini dilakukan setelah semua protein yang sudah terpisah-pisah dalam gel dipindahkan pada sehelai kertas nitroselulosa dengan cara blotting.

Elektroforesis protein gel poliakrilamida SDS dianggap sebagai prosedur yang lebih baik dibandingkan dengan metode-metode analisis yang terdahulu terutama karena dapat digunakan untuk memisahkan jenis-jenis protein, termasuk protein-protein yang tidak larut dalam air. Protein-protein membran, protein-protein yang kompleks protein. merupakan komponen kerangka sel dan protein-protein yang merupakan bagian dari persatuan makromolekul yang lebih besar dapat diuraikan dengan metode ini. Karena metode ini memisahkan polipeptida menurut ukuran masing-masing maka akan diperoeleh informasi mengenai berat molekul dan komposisi sub unit pada suatu kompleks protein (Gambar 1). Foto gel yang telah digunakan untuk menganalisis tahapan-tahapan berurutan dalam pemurnian sebuah protein dapat dilihat dalam Gambar 2.

Gambar 1. Elektroforesis SDS gel poliakrilamida.

       Gambar 2. Analisis sampel protein dengan elektroforesis SDS gel poliakrilamida.

Elektroforesis protein dengan gel poliakrilamida SDS ternyata juga memiliki kelemahan karena pita-pita atau puncak-puncak protein yang terlalu rapat cenderung saling tumpang tindih sehingga hanya mampu menguraikan protein dalam jumlah yang relatif kecil (umumnya kurang dari 50). Oleh karena itu dikenal pula bentuk perkembangan dari  metode ini yang dikenal dengan elektroforesis gel dua dimensi. Metode elektrofresis gel dua dimensi ini menggabungkan dua prosedur pemisahan berbeda. Metode ini dapat digunakan untuk menguraikan lebih dari 1000 macam protein melalui pemetaan dua dimensi.

Langkah pertama dari elektroforesis gel dua dimensi adalah memisahkan protein-protein berdasarkan muatan yang dimilikinya. Untuk ini, sampel dilarutkan dalam sedikit larutan yang mengandung detergent non-ionik (tidak bermuatan) yang dicampur dengan merkaptoetanol dan reagen pengubah sifat urea. Larutan ini melarutkan, mengubah sifat dan menguraikan semua rantai polipeptida tanpa mengubah muatan asli masing-masing. Rantai-rantai polipeptida itu kemudian dipisah-pisahkan dengan sebuah prosedur yang disebut isoelectric focusing, sesuai kenyataan bahwa muatan netto sebuah molekul protein bervariasi terhadap pH larutan di sekelilingnya. Untuk setiap protein terdapat sebuah pH karakteristik, juga disebut titik isoelektrik, yaitu keadaan ketika protein tidak memiliki muatan netto dan karena itu tidak akan bermigrasi dalam suatu medan listrik. Dalam isoelectric focusing, protein-protein dielektroforesis dalam sebuah tabung sempit berisi gel poliakrilamida yang memiliki gradien pH berkat adanya suatu campuran penyangga khusus. Dalam pengaruh suatu medan listrik, setiap protein bergerak ke sebuah posisi  dalam gradien yang sesuai dengan titik isoelektriknya dan tetap berada di tempat itu (Gambar 3). Inilah yang disebut dimensi pertama pada elektroforesis gel dua dimensi.

Gambar 3. Pemisahan molekul-molekul protein dengan isoelectric focusing.

Dalam tahapan kedua, gel sempit dengan protein-protein yang telah menjalani fraksionasi itu dielektroforesis lagi tetapi dalam arah tegak lurus terhadap arah pada fraksionasi tahap pertama. Pada tahap ini SDS ditambahkan ke dalam gel sehingga protein-protein menjalani pemisahan menurut ukuran seperti dalam SDS-page satu dimensi. Gel dalam tabung sempit tadi dicelupkan ke dalam SDS kemudian diletakkan di salah satu ujung sebuah lempengan gel poliakrilamida SDS. Dari tahap inilah setiap rantai polipeptida bermigrasi membentuk titik-titik yang berlainan. Inilah dimensi kedua dalam elektroforesis gel poliakrilamida dua dimensi.

Protein-protein yang akan tetap tidak terurai adalah protein-protein yang mempunyai ukuran serta titik isoelektrik yang sama, meskipun situasi seperti ini sangat jarang ditemui. Pada gel tersebut, bahkan setiap rantai polipeptida dalam jumlah yang sangat kecil pun dapat dideteksi dengan berbagai prosedur pewarnaan atau dengan otoradiografi jika protein sampel telah diberi label dengan radioisotop. Hingga 2000 macam rantai polipeptida mampu diuraikan menggunakan satu gel saja. Jumlah protein ini hampir sama dengan jumlah protein berbeda dalam sebuah bakteri. Daya penguraian metode ini begitu besarnya sehingga dua buah protein yang hanya berbeda dalam sebuah asam amino bermuatannya dapat dikendalikan dengan mudah.

Elektroforesis SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) dapat digunakan untuk mengetahui ekspresi protein mikroorganisme. Sebagaimana yang dilakukan oleh Suranto (2007). Elektroforesis protein dilakukan dengan menuangkan 5 mL kultur bakteri ke dalam tabung ependorf 1,5 mL dan sel-selnya diendapkan dengan disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Endapan sel dibersihkan dari media LB cair dengan membuang supernatannya sedangkan pelet sel yang mengendap disuspensi dengan Phospat Buffered Saline Solution (PBS) sebanyak dua kali, kemudian disentrifuse kembali, dan supernatan PBS dibuang. Pelet kemudian ditambahkan 1 mL PBS. Untuk memecah sel digunakan sonikasi selama 30 detik sebanyak 4 kali, disentrifuse ulang dan diambil supernatannya untuk dirunning dengan menambahkan buffer sampel (4:1/v:v). Sebelum diloading ke dalam sumuran, campuran sampel dan buffer sampel direbus dalam air mendidih selama 2 menit, kemudian dimasukkan ke dalam es selama + 5 menit, setelah itu sampel siap dirunning. Gel yang sudah terbentuk (discontinous gel 10 % dan stacking gel 3%), dipindahkan ke dalam tangki elektroforesis (Hames & Rickwood, 1990). Selanjutnya tangki elektroforesis diisi dengan running buffer (0,19 M Glycine, 10 ml SDS 10 %, dan 0,0248 M Tris dalam 1 Liter) hingga penuh. Selanjutnya diletakkan 10 μL mikropipet campuran sampel dan buffer sampel kemudian dimasukkan ke dalam sumuran elektroforesis secara hati-hati. Setelah semua sampel masuk dalam sumuran pasang tutup tanki dan atur voltase (100V, 90 menit).

Pewarnaan dengan menggunakan metode Comassie Blue untuk pewarnaan protein. Larutan dibuat dengan komposisi 1 g zat warna Comassie Blue dilarutkan dalam 1 L larutan distaining (100 ml asam asetat, 400 mL metanol, kemudian diencerkan dengan penambahan akuades hingga mencapai volume 1 L). (Hames & Rickwood, 1990). Setelah dirunning, gel direndam dalam larutan pewarna Comassie Blue selama 12 jam, kemudian dicuci dengan destainig sebanyak 3-4 kali selama 2 jam hingga didapatkan pola pita protein yang terbentuk. Hasilnya diperlihatkan pada gambar 4.

Gambar 4. Ekspresi protein pada lima macam mikroorganisme yang ditumbuhkan pada media cair LB dengan konsentrasi Cr(VI) 0 ppm dan 10 ppm.

 

REFERENSI:

Alberts, B. et al. 1994. Biologi Molekuler Sel. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.

Hames, B.D & Rickwood.1990. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert E Krieger Publishing Company.

Suranto, et al. 2007. Ekspresi Protein pada Mikroorganisme Resisten Logam Berat Cr dengan Metode Elektroforesis. Jurnal Biosains.